آزمایش میکروسکوپی نمونه های مدفوع

معمولا آزمایش میکروسکوپی نمونه های مدفوع متشکل از سه مرحله جداگانه شامل :

الف ـ تهیه گسترش مستقیم ( مرطوب )

گسترش مستقیم را می توان در کوتاهترین مدت و با حداقل امکانات تهیه نمود.

در صورت مثبت بودن آن از نظر وجود انگل ، می توان یک گزارش اولیه سریع به پزشک ارائه داد و گزارش نهایی را موکول به انجام آزمایش با استفاده از روشهای تلغیظ و رنگ آمیزی دائمی نمود.

در آزمایش مستقیم به علت برداشت حجم بسیار کمی از مدفوع، امکان دستیابی به انگل خیلی کم است. همچنین در صورت یافتن انگل، به علت اینکه بعضی از تک یاخته ها خیلی کوچک می‌باشند به سختی می توان در گسترش مستقیم نوع آنها را تعیین نمود .

اهداف تهیه گسترش مستقیم شامل :

۱.  ارزیابی میزان آلودگی بیمار

۲.  تشخیص سریع نمونه هایی که آلودگی شدید دارند

۳.  بررسی حرکت ارگانیسم می باشد

این روش آماده سازی باید بر روی نمونه های تازه مدفوع که در یخچال نگهداری نشده و یا با مواد نگهدارنده مخلوط نگردیده است، انجام گیرد. در این روش ، مراحل مختلف زندگی اغلب انگلهای روده ای ( تروفوزوئیت، کیست ، لارو و تخم )، اووسیست کوکسیدیاها، اجسام کروماتوئید موجود در کیست و حرکت تروفوزوئیت ها را می توان تشخیص داد.

در مورد نمونه های تازه ای که در ماده نگهدارنده قرار داده نشده اند، محلول ۸۵% کلرورسدیم در آب و یا محلول ید به عنوان رقیق کننده استفاده می شود. برای نمونه های نگهداری شده در فرمالین و یا مواد نگهدارنده دیگر، مواد نگهدارنده نقش رقیق کننده را نیز ایفا می کنند.

باید توجه نمود که ید و مواد نگهدارنده مانند فرمالین باعث کشته شدن ارگانیسم شده و حرکت آن را نمی توان بررسی نمود.

تهیه گسترش مستقیم با محلول ید باعث می شود که هسته و بیشتر عناصر داخل کیستهای انگل مشخص گردند. معمولا در این گونه آماده سازی ، تروفوزوئیت ها شکل طبیعی خود را از دست می دهند. تخم کرمها و لاروها قابل شناسایی هستند اما بعضا جزئیات داخلی آنها نامشخص می شود  برای تشخیص اولیه اووسیست کریپتوسپوریدیوم تهیه نمونه با محلول ید پیشنهاد می گردد، زیرا معمولا اووسیستها ید را جذب نکرده و شفاف می مانند ( بر خلاف مخمرها و دیگر عناصر مدفوع که

رنگ زرد ید را جذب می نمایند ) اما به هر حال باید تشخیص قطعی کریپتوسپوریدیوم با رنگ آمیزیهای اختصاصی و یا استفاده از کیت دارای آنتی بادی منوکلونال اختصاصی انجام گیرد .

اووسیست ایزوسپورابلی نیز میتواند در گسترش مستقیم دیده شود . اسپورهای میکروسپوریدیا آنقدر کوچک هستند که ممکن است با ذره های کوچک موجود در محیط اشتباه شوند ، بنابر این در گسترش مستقیم ممکن است تشخیص صحیح داده نشوند.

در امتحان میکروسکوپی نمونه مدفوع ممکن است عناصر زیر دیده شوند :

۱.  ترفوزوئیت و کیست تک یاخته های روده ای

۲.   اووسیست کوکسید یا و اسپورهای میکرسپوریدیا که تشخیص این اسپورها از ذره های کوچک موجود در محیط مشکل است .

۳.   تخم کرمها و لاروها

۴.  گلبولهای قرمز که ممکن است دلیل زخم یا عوامل دیگر خونریزی دهنده باشد .

۵.  گلبولهای سفید مخصوصا نوتروفیلها که ممکن است دلیل التهاب باشد .

۶.   ائوزینوفیلها که معمولا دلیل وجود یک پاسخ ایمنی است ( که ممکن است در ارتباط با وجود عفونتهای انگلی و یا علل دیگر باشد ) .

۷.  ماکروفاژها که ممکن است به دلیل حضور عفونتهای باکتریایی یا انگلی باشد .

۸. کریستالهای شارکوت لیدن که بقایای ائوزینوفیلهای تخریب شده است (ممکن است در ارتباط با وجود عفونتهای انگلی و یا علل  دیگر باشد ) .

۹.   قارچها ( انواع کاندیدا ) و مخمرهای دیگر و یا قارچهای شبه مخمر .

۱۰.  سلولهای گیاهی ، دانه های گرده و اسپورهای قارچها که ممکن است شبیه تخم کرمها، کیست تک یاخته ها و اووسیست کوکسیدیا و اسپورهای میکروسپوریدیا باشد .

۱۱.  فیبر یا ریشه گیاهان و یا موی حیوانات که ممکن است شبیه لارو کرمها باشد .

تهیه محلول سرم فیزیولوژی :

۱. ۸۵ /۰ گرم کلروسدیم (Nacl ) را در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر به خوبی حل کنید .

به میزان ۱۰ میلی لیتر به داخل ۱۰ لوله در پیچ دار بریزید . لوله ها را در دمای c۱۲۱  به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو نمائید و بعد از سردشدن در یخچال c۴ نگهداری کنید . ( در صورت در دسترس نبودن لوله در پیچ دار پس از استریل نمودن می توان ، جهت جلوگیری از تبخیر محلول در لوله را با پارافیلم کاملا ببندید ) روی برچسب لوله نام محلول و تاریخ انقضا آن را به مدت حداکثر یک سال بعد از تاریخ ساخت بنویسید .

تهیه محلول iodine‘Anton’D

مواد لازم :

۱.  یدور پتاسیم (Potassuim iodide = k۱) یک گرم

۲.  کریستال ید پودر شده ( Iodine crystals )   پنج گرم

۳.  آب مقطر تا ۱۰۰ میلی لیتر

یدور پتاسیم و کریستالهای ید را در آب مقطر حل کنید . ( مقدار اضافی کریستالهای حل نشده ید در ته ظرف باقی می ماند که به دلیل وجود این کریستالها، محلول ذخیره در مدت زمان طولانی، دارای کیفیت مطلوب می باشد بنابراین محلول را صاف ننمائید.)

محلول فوق را در شیشه قهوه ای رنگ ریخته و در محل تاریک، در حرارت اطاق نگهداری نمائید. این محلول جهت استفاده فوری بکار می رود، بنابراین مقداری از آن را به عنوان محلول کاری در دسترس قرار دهید. رنگ محلول کاری باید شبیه چای پر رنگ باشد و چنانچه در مدت ۱۴ـ۱۰ روز رنگ آن روشن تر گردد، باید دور ریخته شود.

روی برچسب شیشه محتوی محلول ذخیره، نام محلول و تاریخ انقضای آن را به مدت حداکثر یکسال بعد از تاریخ ساخت بنویسید.

تهیه محلول لوگل ( Lugols iodine )

مواد لازم :

۱.  یدور پتاسیم  ۱۰ گرم،

۲.  کریستال ید پودر نشده ۵ گرم،

۳.   آب مقطر  ۱۰۰ میلی متر

( مراحل اشاره شده در مورد تهیه محلول ید و این محلول مشابه است )

جهت ساخت محلول کاری از محلول ذخیره به نسبت ۱:۵ آن را با آب مقطر رقیق نموده و داخل شیشه قهوه ای رنگ ( قطره چکان ) نگهداری می نمائیم.

تهیه رنگ متیلن بلوی با فره ( گسترش مستقیم )

(Nairs Buffered Methylene blue stain  Direct smear)

این روش آماده سازی گسترش مستقیم جهت مشخص نمودن جزئیات هسته تروفوزوئیتها و افتراق آنها از ماکروفاژها بکار می رود، بویژه زمانی که از محلول با PH پائین استفاده شود که سبب نفوذ هر چه بیشتر رنگ به داخل ارگانیسم می گردد.

بعد از ۵ تا ۱۰ دقیقه سیتوپلاسم به رنگ آبی کمرنگ و هسته به رنگ آبی بسیار پر رنگ دیده می شود گسترشها باید در مدت ۳۰ دقیقه مورد بررسی قرارگیرند.

روش کار

۱. تهیه محلول ذخیره A

۵۵/۱۱ میلی لیتر از اسید استیک (CH۳COOH)   را با آب مقطر به حجم ۱۰۰۰ میلی لیتر می رسانیم .

1. تهیه محلول ذخیره B

۴/۱۶ گرم استات سدیم بدون آب  (Nac۲ H۳O۲ ) و یا ۲/۲۷ گرم استات سدیم با ۳ ملکول آب (NaC HO ۳HO) را در آب مقطر حل نموده و حجم نهائی را به ۱۰۰ میلی لیتر می رسانیم:

طبق جدول زیر محلول B, A را مخلوط نموده و با آب مقطر به حجم ۱۰ میلی لیتر می رسانیم :

۰۶/۰ گرم ( ۶۰ میلی گرم ) پودر میتلن بلو را به ۱۰۰ میلی لیتر از محلول بافر اضافه کرده و کاملا حل می نمائیم. معمولا استفاده از بافر استات با  ۶/۳PH =  بهترین نتیجه را ایجاد می کند.

روش انجام آزمایش مستقیم :

۱.      یک قطره سرم فیزیولوژی ۸۵/۰% را در طرف چپ و یک قطره از محلول لوگل را در طرف راست لام قرار می دهیم.

۲.      مقدار خیلی کمی از مدفوع ( به اندازه ۲ میلی گرم و یا در حدی که فقط نوک یک اپلیکاتور را به داخل نمونه فرو کنیم ) را در سرم فیزیولوژی به حالت یکنواخت در می آوریم. اگر بیشتر از این مقدار برداشت شود، گسترش غلیظ شده و یافتن انگل مشکل می شود. و چنانچه مقدار کمتری از نمونه برداشته شود، گسترش رقیق شده و احتمال مشاهده انگل کم می شود.

عمل فوق را به وسیله اپلیکاتور دیگری با محلول لوگل انجام می دهیم. می توان یک قطره از محلول متیلن بلوی بافره را نیز بر روی لام دیگری قرارداد و به طریق فوق نمونه مدفوع را در آن به حالت یکنواخت در آورد.

جهت بررسی نمونه های فوق یک لامل (mm)      ۲۲×۲۲ بر روی نمونه تهیه شده قرار می دهیم .

ترجیحا می توان نمونه های تهیه شده در سرم فیزیو لوژی و ید را بر روی لامهای جداگانه ای قرار داد که در این صورت امکان جاری شدن مایع بر روی میکروسکوپ کاهش می یابد .

اگر نمونه آبکی یا موکوئیدی باشد ، نمونه برداری بوسیله اپلیکاتور مشکل است ، لذا از دو اپلیکاتور به کمک هم طوری استفاده کنید که حالت یک قاشقک را ایجاد نماید .

جهت بررسی گسترش ابتدا با عدسی با بزرگنمایی کم (۱۰× ) تمام قسمتهای گسترش (لامل ) رابررسی می کنیم . اگر مورد مشکوکی مشاهده گردید از عدسی با بزرگنمایی (۴۰ × ) برای بررسی جزئیات استفاده می نماییم . حتی در مواردی که مورد مشکوکی مشاهده نگردید ، حداقل یک سوم لامل باید با عدسی با بزرگنمایی (۴۰ × ) مورد بررسی مجدد قرار گیرد .

معمولا تک یاخته ها نور را منعکس می کنند و چون این گونه ارگانیسمها کمرنگ میباشند ، می توانند نور را ازخود عبور دهند و مشاهده آنها مشکل گردد ، بنابراین باید با نور کم گسترشها را بررسی نمود .

زمانیکه نور زیاد باشد بیشتر ارگانیسمها به خوبی مشاهده نمی شوند ( تجربه نویسنده : بخصوص در زمانیکه نمونه محتوی اووسیست ایزوسپورابلی باشد ) .

بهتر است عمل کاهش نور را به جای پایین آوردن کندانسور با بستن دیافراگم انجام دهید . میزان نور باید به نحوی تنظیم شود که عناصر سلولی موجود در مدفوع بخصوص کیست تک یاخته ها بتوانند نور را منعکس کنند.

اگر اطراف لامل کاملا با پارافین مذاب مسدود شده باشد ، می توان با استفاده از عدسی روغنی ( بزرگنمایی ۱۰۰ × ) آن را بررسی نمود . ترجیحا در این موارد استفاده لامل ضخیم توصیه میشود .

در صورت استفاده از محلول غلیظ ید عناصر داخل مدفوع به یکدیگر چسبیده و سبب کاهش انکسار ، عبور نور از ارگانیسم و اشکال در تشخیص می گردد و چنانچه محلول رقیق ید مورد استفاده قرار گیرد ، عناصر داخل ارگانیسم به خوبی رنگ نمی گیرند . استفاده از محلول لوگلی که در رنگ آمیزی باکتریها استفاده می شود ، به دلیل غلظت آن جهت رنگ آمیزی انگلها توصیه نمی گردد .

چنانچه در بررسی گسترش ، حرکت تروفوزوئیت کم شده باشد ، می توان با قرار دادن یک سکه کوچک گرم شده در کنار گسترش ، حرکت آن را تحریک نمود . همچنین با فشار روی لامل نیز می توان باعث حرکت مایع و تحریک تروفوزوئیت جهت حرکت نمودن گردید.

گزارش نتایج :

مثالهایی از گزارش نتیجه مثبت مدفوع ، شامل موارد زیر می باشد :

۱.     Giardia lamblia trophozites present

۲.     Entamoeba coli cysts present

۳.     Ascaris lumbricoides eggs present

۴.     Strongyloides stercoralis larva present

۵.     Isospora belli oocysts present

همه عناصر و سلولهای موجود در نمونه مدفوع نیز باید تشخیص داده شده و گزارش گردند مانند:

Moderate charcot _ leden crystals present.

Few red blood cells ( RBCS ) present