تست آنتی بیوگرام

گزارش کار آزمایشگاه میکروب شناسی 

تست آنتی بیوگرام

آنتی بیوگرام : این تست جهت تعیین حساسیت باکتری ها به آنتی بیوتیک های مختلف به کار می رود

از محیط کشت MHA (MUELLR HINTON AGAR) برای این تست استفاده می شود. از دیسک های حاوی مقادیر مشخص آنتی بیوتیک های مختلف بر روی کشتی از باکتری ها استفاده می شود که باعث نفوذ آنتی بیوتیک در آگار می شود و ناحیه ی موثر توسط باکتری ها به وسیله ی عدم رشد باکتری مشخص می شود. هر چه تاثیر آنتی بیوتیک بر روی باکتری بیشتر باشد قطر هاله ی عدم رشد نیز بیشتر می شود.

وسائل و موارد مورد نیاز برای تست انتی بیوگرام "دیسک دیفیوژن"

1. محیط کشت که آنتی بیوگرام بر روی آن انجام می شود که "آگار مولر هینتون" می باشد 
2. لوله حاوی نیم مک فارلند .
3. لوله حاوی یک سی سی سرم فیزیولوژِی استریل
4. دیسک های انتی بیوگرام
5. باکتری خالص در محیط کشت مناسب
6. سواب ، انس ، شعله ، هود ، چراغ

استاندارد نیم مک فارلند :

روش انجام کار:

استاندارد نيم مک فارلند سولفات باريم به روش زير تهيه مي شود:

1) 5/0 ميلي‌ ليتر از کلرور باريم BaCl2) )۰/۰۴۸ mol/L(W/V BaCl₂/H₂O) ۱/۱۷۵% ) را به 5/99 ميلی‌ليتراسيد سولفوريک mol/L (۱% V/V) ۰/۱۸ اضافه کنيد و با هم زدن مداوم يک سوسپانسيون تهيه نمائيد.

2) چگالي صحيح کدورت استاندارد با استفاده از اندازه گيري جذب در اسپکترو فوتومتر با طول مسیر نوري یک سانتی متر، مشخص شود. جذب در ۶۲۵ نانومتر بايد بين 08/0 تا 13/0 باشد.

3 روش برای تست آنتی بیوگرام وجود دارد :

• دیسک دیفیوژن
• آگار دایلوشن
• براث دایلوشن

روش انجام تست  دیسک دیفیوژن:

بعد از ایزوله کردن باکتری ، مقداری از کلونی باکتری را به وسیله انس (نه لوپ) برداشته و در سرم فیزیولوژی استریل حل می کنیم . باید در نظر داشت که چون ، در تست آنتی بیوگرام میزان کدر بودن برای ما خیلی مهم است ، بنابراین در انتخاب مقدار نمونه باید دقت کنیم تا نمونه را بیشتر یا کمتر از نیم مک فارلند برنداریم . اگر میزان کدورت کمتر از نیم مکفارلند باشد ، مقداری دیگر از نمونه را در سرم فیزیولوژی استریل حل می کنیم و یا اگر میزان کدر بودن ، بیشتر از نیم مک فارلند باشد در این صورت باید مقداری سرم فیزیولوژی استریل اضافه کرد تا به کدورت مناسب و برابر با نیم مک فارلند برسیم . بعد از تهیه محلول هموژن خود ، با سواب استریل محلول را به هم زده و بعد از آبکشی کردن سواب ، (برای آب کشی ، سواب را با قدرت به دیواره لوله تکیه داده و فشار دهید تا آب آن گرفته شود .) آن را به محیط کشت مولر هینتون انتقال می دهیم و به طور کامل به وسیله سواب ، محیط کشت را به صورت چمنی کشت می دهیم به طوری که هیچ محلی در محیط از قلم نیافتد  . بعد از کشت ، دیسک های انتی بیوگرام که قبل از نیم ساعت از تست ، بیرون یخچال قرار داده شده اند را انتخاب و بر روی محیط کشت انتقال می دهیم . باید ذکر کنم که نحوه قرار دادن دیسک ها در محیط کشت مولر هینتون ، به صورت دایره ای  است و فاصله این دیسک ها از هم دیگر حدود 12 میلیمتر باشد و باید از دیواره هم فاصله داشته باشند . در ضمن فاصله این دیسک ها را می توان با توجه به تجربه خود کم و یا زیاد کنیم . دیسک های مورد استفاده هم باید با نوع باکتری ایزوله شده ما مناسب باشد مثلا هیچ وقت برای باکتری گرم منفی ، پنی سیلین قرار نمی دهیم چون نسبت به آن مقاوم هستند و یا اینکه آنتی بیوتیک کلروامفینیکل را برای کشت ادرار قرار نمی دهیم چون این انتی بیوتیک نمی تواند وارد مجاری ادراری شود و... بعد از قرار دادن دیسک ها ، در پلیت را بسته و به مدت 24 ساعت آنها را در دمای 37 درجه سانتیگراد ، انکوبه می کنیم (لازم به ذکر است که بنابه به تحقیقات تازه محقین ، دمای انکوبه برای آنتی بیوگرام به ۳۵ درجه کاهش یافته است و مدت زمان آن هم به ۱۶ تا ۱۸ ساعت کاهش یافته است ) . بعد از 24 ساعت پلیت را زیر چراغ برسی می کنیم  .آنگاه مي‌بايد قطر هاله عدم رشد را با خط‌كش اندازه گيري کرد و با توجه به جدول همراه دیسک ها ، گزارش تست انتی بیوگرام خود را برای هر یک از انتی بیوتیک ها ، به صورت حساس (Susceptible ) ،مقاوم (Resistant) و یا نیمه حساس (Intermediate) گزارش می شود .

همان طور که مشاهده می کنید در اطراف برخی از دیسک ها هاله روش وجود دارد که این نشان دهنده حساس بودن ان بکتری به ان دیسک است و باید حساس گزارش شود . همچنین در اطراف بعضی از دیسکها هیچ گونه هاله ای نیست در این حالت این باکتری را باید نسبت به ان دیسک مقاوم گزارش داد . اگر طبق جدول خود هیچ یک از حالات فوق مشاهده نشود در اینصورت نیمه حساس را گزارش می کنیم .

و چند نکته مهم  :

• در اندازه گیری از خط کش معمولی و یا ویژه این کار استفاده کنید .
• همیشه امتداد خط کش باید از وسط دیسک عبور کند .
• همیشه قطر اندازه گیری می شود .
• باید در تست انتی بیوگرام ، نگاه بدبینانه ای داشت . یعنی اینکه کوتاهترین مسیر را برای تعیین حساسیت انتخاب می کنیم .
• اگر در اطراف دیسک خط هایی کشیده شده باشد در این صورت باید از اخرین خطی که بعد از ان دیگر کلونی نیست تعیین حساسیت کرد.
• اگر در اطراف دیسک حتی یک کلونی هم باشد باید از همان جا تا دیسک را اندازه گیری کرد نه کل هاله را .
• همیشه به محل هاله دقت کنید بازم می گم همیشه و کوتاهترین مسیر ار انتخا کنید .
• دیسک ها و هاله ها را در زیر نور برسی کنید .

• آمینوگلیکوزید ها بر روی باکتری های بی هوازی تاثیر می گذارند .
• کلروامفینیکل در نمونه ادراری استفاده نمی شود چون وارد ادرار نمی شود .
• ونکومایسن ، اریترومایسن ، کلیندمایسن ، پنی سیلین و چند تا دیگه بر روی باکتری های گرم مثبت تاثیر می ذارند .
•  دیسک ایمیپنم هم برروی گرم مثبت و هم بر روی گرم منفی تاثیر دارد ولی باید در عفونت های شدیدی استفاده شد تا مقاومت ایجاد نشود .
• سفالکسین که بر روی گرم مثبت و منفی تاثیر دارد به صورت خوراکی است .
• تتراسایکلین آنتی بوتیک وسیع الطیفی است و معمولا به صورت موضعی استفاده می شود