رنگ آمیزی گرم

رنگ آمیزی گرم

اصول:

در آزمايشگاه ميكروب شناسي باليني، رنگ آميزي گرم آزمايشي مهم براي تشخيص احتمالي سريع عوامل عفوني است و كيفيت نمونه هاي باليني را ارزيابي مي كند . اين آزمايش براي طبقه بندي باكتري ها بر اساس شكل، اندازه، مورفولوژي سلول و واكنش گرم آنها به كار مي رود.  

تفسير گسترش هايي كه رنگ آميزي گرم شده اند، با در نظر گرفتن مشخصه هاي رنگ آميزي ، اندازه، شكل و آرايش سلول صورت می گيرد. اين مشخصه ها ممكن است بوسيله بسياري از فاكتورها مانند مدت زمان ماندگی پليت ها، محيط کشت، اتمسفر انكوباسيون ، روش رنگ آميزي و وجود مواد مهاركننده تحت تأثير قرار بگيرند. براي تفسير اسميرهاي تهيه شده از نمونه هاي باليني مانند خلط، به وجود عوامل اضافي مانند انواع سلول هاي ميزبان و فاگوسيتوز نيز می بايست دقت نمود .

مواد:

A. معرف ها

معرف ها ممكن است به صورت تجاري خريداري شوند يا در آزمايشگاه تهيه گردند.

1. كريستال ويوله
2. يد

احتياط: يد خاصيت خورندگي دارد. از استنشاق، خوردن يا تماس آن با پوست خودداري كنيد.

  .c رنگ برها :

1)  كندترين رنگ بر:  اتانول  95 %

2)  رنگ بر متوسط: استون ـ الكل؛ مخلوطي از ml 100 اتانول 95%  و  ml100 استون (reagent grade ) را در بطري شيشه اي قهوه اي رنگ تركيب كنيد، با يك سال تاريخ انقضاء، برچسب بزنيد و در حرارت اتاق نگهداري كنيد.

3)  سريع ترين رنگ بر: استون  (reagent grade )

احتياط: اتانول و استون قابل اشتعال هستند.   

 Counterstains (رنگ متقابل)     :   سافرانين 

.B وسايل و مواد مورد نياز

1-  لام شيشه اي

2-  پي پت پاستور و اپليكاتور چوبي استريل

3-  لوپ ، آنس

4-  روغن ايمرسيون 

نكته: متانول را در بطري هاي درپيچ دار قهوه اي ذخيره كنيد. ذخيره كاري را مي توان در ظروف پلاستيكي براي حداكثر دو هفته ذخيره نمود .

 روش انجام آزمایش :

1) تهیه اسمیر :  برای تهیه اسمیر از لام های شیشه ایی نو و تمیز استفاده می کنیم  که 2 حالت دارد :

• از محیط کشت جامد : 1 قطره سرم فیزیولوژی یا آب وسط لام میریزیم سپس با آنس از کلونی داخل پیپت برداشته و داخل آب حل می کنیم
• از محیط کشت مایع : بوسیله لوپ لام میگیریم            

2) خشک کردن : یا روی میز یا نزدیک شعله خشک میکنیم

3) مرحله فیکساسیون : 3 بار به آرامی از شعله رد می کنیم که پروتئین ها دناتوره می شوند و به لام محکم می چسبند

4) رنگ آمیزی :

اولین رنگ : کریستال ویوله

مقداری از رنگ را با پیپت پاستور می کشیم و میریزیم روی لام و 1 دقیقه زمان می دهیم ، سپس لام را بر می گردانیم و میگیریم زیر شیر آب

سپس استون الکل که سبس حل شدن چربی های دیواره سلولی باکری می شود

باکتری های گرم مثبت : مانع خروج رنگ می شود

گرم منفی : با اضافه شدن استون الکل از حفره های دیواره اش رنگ خارج می شود

سپسس افارین اضافه میکنیم و پس از 30 ثانیه زیر آب شستشو می دهیم .

در گرم منفی ها : قرمز

در گرم مثبت ها : بنفش

نمونه های ازمایش :

گرم مثبت کوکسی : استافیلوکوک

باسیل گرم منفی : e-coli